Понятие, механизм и последовательность осуществления фагоцитоза

Что такое фагоцитоз?

Фагоцитоз – это процесс, при котором клетка связывается с необходимой частицей на поверхности, а затем обволакивает и погружает ее в внутрь. Процесс фагоцитоза часто происходит, когда клетка пытается уничтожить что-то, например вирус или инфицированную клетку, и часто используется клетками иммунной системы.

Фагоцитоз не произойдет, если клетка не находится в физическом контакте с частицей, которую она хочет поглотить. Рецепторы клеточной поверхности, используемые для фагоцитоза, зависят от типа клетки. Это самые распространенные из них:

• Рецепторы опсонинов: используются для связывания бактерий или других частиц, которые были покрыты иммуноглобулиновыми G (или IgG) антителами иммунной системой. Иммунная система покрывает потенциальные угрозы в антителах, чтобы другие клетки знали, что их нужно уничтожить. Также, иммунная система может использовать группу сложных белков для маркировки бактерий, называемых системой комплемента. Система комплемента – еще один способ иммунной системы уничтожать патогены и угрозы для организма.
• Рецепторы мусорщики: связываются с молекулами, которые продуцируются бактериями. Большинство бактерий и клеток производят матрицу протеинов, окружающих себя (называемую «внеклеточным матриксом»). Матрикс является идеальным способом для иммунной системы идентифицировать чужеродные виды в организме, поскольку клетки человека не продуцируют одну и ту же белковую матрицу.
• Толл-подобные рецепторы: рецепторы, названные в честь аналогичного рецептора у плодовых мух, кодируемых геном Toll, которые связываются с определенными молекулами, продуцируемыми бактериями. Толл-подобные рецепторы являются ключевой частью врожденной иммунной системы, так как будучи связанными с бактериальным возбудителем, они распознают специфические бактерии и активируют иммунный ответ. Существует множество различных типов Толл-подобных рецепторов, продуцируемых организмом, все из которых связывают разные молекулы.
• Антитела: некоторые иммунные клетки образуют антитела, связывающие с конкретными антигенами. Это процесс, сходный тому, как подобные рецепторы распознают и идентифицируют, какой тип бактерий заражает хозяина. Антигены – это молекулы, действующие как патогенная «визитная карточка», потому что они помогают иммунной системе понять с какой угрозой она имеет дело.

Механизмы уничтожения чужеродных агентов

Кислородозависимый внутриклеточный фагоцитоз

При осуществлении захвата патогена увеличивается потребность организма в кислороде, поскольку именно из него образуются перекись водорода и гидроксильные радикалы. Эти активные формы обладают способностью к разрушению микроорганизмов благодаря своим токсичным свойствам. 

Кислородонезависимый внутриклеточный фагоцитоз

Существуют пути ликвидации вредоносной частицы, не зависящие от кислорода. Они считаются менее действенными. Характерной особенностью кислородонезависимый способ фагоцитоза является использование:

• электрически заряженных белков, повреждающих мембрану клетки;
• лизозимов, разрушающих стенку бактерицидной клетки; 
• лактоферринов, удаляющих из патогенов железо;
• протеаз и гидролаз, которые участвуют в переваривании белков разрушенных вредителей.

Внеклеточный путь фагоцитоза

Активизированные макрофаги выделяют оксид азота. На первом этапе происходит внутриклеточный синтез этого вещества. Затем после контакта клетки-поглотителя с агрессором оксид азота высвобождается. Рост опухоли стимулирует выброс цитокинов, осуществляющих борьбу с раковыми клетками. 

Как изучение трогоцитоза может помочь в онкотерапии?

За последние годы иммунотерапия CAR-T клетками продемонстрировала многообещающие результаты для лечения В-клеточных лимфом, но, к сожалению, у некоторых пациентов все равно наблюдались рецидивы, и часть из них объяснялась снижением числа антигенов на раковых клетках. В 2019 г. в Nature вышла статья, где говорилось, что в этом виноваты сами CAR-T, как удалось выяснить на мышиной модели лейкоза . С помощью трогоцитоза они мало того что забирали антигены у раковых клеток, так еще и провоцировали братоубийство за счет кросс-дрессинга, в результате чего другие CAR-T клетки начинали нападать на собратьев, зачем-то нацепивших на себя эти опухолевые антигены. Авторы предполагают, что возможно найти механизмы, регулирующие «склонность» CAR-T клеток к трогоцитозу. А в перспективе это дает надежду на усовершенствование CAR-T терапии, если эти молекулярные механизмы регуляции трогоцитоза будут еще лучше изучены.

Трогоцитоз помогает ученым находить MHC-ассоциированные антигены

Одна из нетривиальных задач иммунологии — это находить, какие Т-клеточные рецепторы (TCR) к каким антигенам специфичны. Секвенировать TCR сегодня умеют весьма неплохо (о чем рассказывает статья «Анализ индивидуальных репертуаров Т-клеточных рецепторов» ), но вот сама по себе последовательность Т-клеточного рецептора ничего не говорит о его антиген-специфичности. Так же, как и знание антигена не подскажет нам, какой клонотип Т-лимфоцитов мог бы стать, например, хорошим кандидатом для инфузионной иммунотерапии. При этом существующие биоинформатические методы предсказания еще недостаточно точны, а экспериментальные способы валидации весьма дороги и трудоемки. Поэтому поиск новых методов установления антиген-специфичности остается актуальным.

Еще в 2003 году ученые попытались использовать трогоцитоз для решения данной проблемы . Они сконструировали АПК, экспрессирующие сшитые с зеленым флуоресцирующим белком (GFP) MHC-I. Такие АПК затем нагружались антигеном и после культивации с Т-клетками активировали специфичные к антигену цитотоксические (CD8+) Т-лимфоциты, что стимулировало в том числе трогоцитоз. Когда эти Т-клетки отщипывали от АПК фрагменты с искусственными pMHC, их можно было легко выявить на клеточном сортере, так как они становили GFP-положительными. Таким способом удалось обнаружить в крови Т-клетки, специфичные к Т-лимфотропному вирусу человека первого типа (HTLV-I), у пациентов с HTLV-I-связанной миелопатией.

Вышеописаный метод был ограничен определенными клеточными линиями, подходящими для трансфекции, спектром поглощения GFP и необходимостью заново создавать такие конструкции для каждого отдельного гена и аллели MHC. Поэтому, чтобы обойти эти сложности, вместо экспрессии химерных белков ученые начали неспецифично биотинилировать мембранные белки АПК с их последующим окрашиванием флурофором . Биотинилированные белки можно легко визуализировать с помощью стрептавидина, конъюгированного с ферментом (например, пероксидазой хрена), субстрат для которого при окислении начинает люминисцировать, и это можно зафиксировать спектрофотометром. В остальном принцип оставался тот же: сортинг Т-клеток, которые после трогоцитоза становились флуорохром-положительными. Плюсом этого метода, который назвали TRAP (-cell recognition of APCs by protein transfer), является возможность вылавливать реагирующие на антиген Т-клетки вне зависимости от их MHC-специфичности.

Еще одна научная группа во главе с Дэвидом Балтимором умудрилась перевернуть трогоцитоз с ног на голову. Обычно Т-клеточный трогоцитоз антигенпрезентирующих клеток (АПК) является однонаправленным, то есть Т-клетки забирают кусочки мембраны с белками у АПК, но не наоборот. Но исследователи продемонстрировали, что искусственно сконструированные АПК, экспрессирующие супрафизиологический уровень эпитопа, могут и сами отбирать мембрану с TCR у Т-клеток, которые специфичны к этим эпитопам . Если пометить мембранные белки Т-клеток с трансдуцированными TCR специальной модификацией биотина, а АПК — каким-то другим флуоресцентным красителем, то по их сочетанию можно на клеточном сортере детектировать АПК, захватившие фрагменты Т-клеток. А если заранее знать специфичность Т-клеточных рецепторов, с одной стороны, а также библиотеку эпитопов, экспонируемых АПК, с другой стороны, то с помощью секвенирования трогоцитоз-положительных АПК мы сможем установить соответствие между эпитопом и TCR, который спровоцировал трогоцитоз у АПК. Звучит запутанно, но суть заключается в том, что таким образом мы можем сопоставить известный нам TCR с одним из заранее известных эпитопов, презентируемых АПК. Метод оригинальный, но он пока еще далек от внедрения в рутинную клиническую диагностику, поскольку построен на искусственно сконструированной системе с известными характеристиками. Поэтому этот метод скорее применим как способ валидации каких-то отобранных другими способами кандидатных антигенов. Например, против какого-то патогена, чьи возможные эпитопы были смоделированы биоинформатически и затем искусственно синтезированны.

Как происходит фагоцитоз?

Чтобы осуществить процесс фагоцитоза, клетки должны выполнить несколько последовательных действий. Имейте в виду, что различные типы клеток выполняют фагоцитоз по разному.

• Вирус и клетка должны вступить в контакт друг с другом. Иногда иммунная клетка случайно попадает в вирус в кровотоке. В других случаях клетки перемещаются посредством процесса, называемого «хемотаксис». Хемотаксис означает движение микроорганизма или клетки в ответ на химический стимул. Многие клетки иммунной системы движутся в ответ на цитокины, небольшие белки, используемые специально для передачи сигналов в клетке. Цитокины сигнализируют клеткам перемещаться в определенную область тела, где обнаружена частица (в нашем случае, вирус). Это характерно для инфекций определенной области (например, рана кожи, пораженная бактериями).
• Вирус связывается с рецепторами на клеточной поверхности макрофага. Помните, что разные типы клеток экспрессируют разные рецепторы. Некоторые рецепторы являются общими, а это означает, что они могут идентифицировать самопроизвольную молекулу по сравнению с потенциальной угрозой, в то время как, другие очень специфичны, например, схожие с подобными рецепторами или антителами. Макрофаг не инициирует фагоцитоз без успешного связывания рецепторов клеточной поверхности.
• Вирусы также могут иметь поверхностные рецепторы, специфичные для вирусов на макрофаге. Вирусы должны получить доступ к цитоплазме или ядру клетки-хозяина, чтобы реплицировать и вызывать инфекцию, поэтому они применяют свои поверхностные рецепторы для взаимодействия с клетками иммунной системы и используют иммунный ответ для входа в клетку. Иногда, когда вирус и клетка-хозяин взаимодействуют, клетка-хозяин может успешно уничтожить вирус и остановить распространение инфекции. В других случаях клетка-хозяин поглощает вирус, который начинает реплицироватся. Как только это произойдет, инфицированная клетка идентифицируется и уничтожается другими клетками иммунной системы, чтобы остановить вирусную репликацию и распространение инфекции.

Макрофаг начинает вращаться вокруг вируса, поглощая его в карман. Вместо того, чтобы перемещать большой элемент через плазматическую мембрану, который может повредить ее, фагоцитоз использует инвагинацию, чтобы захватить частицу внутрь, обволакивая ее вокруг. Инвагинация – это действие сгибания внутрь себя, чтобы сформировать полость или мешочек. Клетка захватывает вирус внутрь, создавая карманное углубление без повреждения плазматической мембраны. Помните, что клетки являются достаточно гибкими и текучими.

Захваченный вирус полностью закрывается в виде пузырьковой структуры, называемой «фагосом», внутри цитоплазмы. Губы кармана, образованные в результате инвагинации, стягивают друг к другу, чтобы закрыть зазор. Это действие создает фагосому, где плазменная мембрана перемещается вокруг частицы, безопасно помещая ее внутри клетки.

• Фагосомы сливаются с лизосомой, становясь «фаголисосомой». Лизосомы также являются пузырчатыми структурами, подобными фагосомам, которые обрабатывают отходы внутри клетки. Для лучшего понимание функций лизосомы, приставка «Лизис» означает разделение или растворение. Без слияния с лизосомой, фагосома не способна ничего сделать с содержимым внутри.
• Фаголисосома понижает pH, чтобы разрушить свое содержимое. Лизосома или фаголисосома способны разрушать вещество внутри себя, резко снижая рН внутренней среды. Снижение рН делает окружающую среду в фаголисосоме очень кислой. Это эффективный способ убить или нейтрализовать все, что находится внутри фаголизосомы, чтобы не допустить заражение клетки. Некоторые вирусы фактически используют пониженный рН, чтобы вырваться из фаголисосомы и начать реплицировать внутри клетки. Например, грипп использует снижение рН для активации конформационного изменения, что позволяет ему выйти в цитоплазму.
• После того, как содержимое было нейтрализовано, фаголизосома образует остаточное тело, которое содержит отходы из фаголисосомы. Остаточное тело в конечном итоге выводится из клетки.

Что мы имеем?

Основным оружием иммунитета пока что остается система комплемента , когда разрушается вся зараженная клетка, ценой собственной жизни спасая соседние клетки от заражения. Соответственно, попытки создать вакцину не увенчиваются весомым успехом, а методы лечения ограничиваются терапией антибактериальными препаратами с наиболее выраженной способностью проникать через мембраны, что является фактором повышенной частоты побочных эффектов из-за системности их влияния на организм — ведь они проникают и в здоровые клетки. Остается только выбирать качественные продукты животного происхождения и проводить тщательнейшую термическую обработку.

Функции фагоцитов

Фагоциты – незаменимое звено иммунной системы. Анализируя главные характеристики разных типов фагоцитарных клеток, можно решить, что их основная задача – защищать от инфекции. Но это далеко не единственная их функция. Они «пожирают» (процесс фагоцитоза) твердые частицы, которые в человеческом организме являются патогенными, очищают кровь, поддерживают здоровье внутренних органов и выполняют еще множество полезных функций.

1. Защита от чужеродных тел

Чтоб понять, как фагоциты выполняют эту функцию, достаточно вспомнить, что происходит, когда вонзается заноза. Если ее сразу не удалить, то вокруг инородного тела образуется очаг воспаления и нагноения, а через некоторое время гной вместе с занозой вырывается наружу. Гной – это отмершие фагоциты, которые таким образом обеспечили защиту от загрязнения инородным телом здоровой ткани организма.

2. Защита от опухолей

Известно, что в результате множества подтвержденных и подозреваемых факторов в организме человека происходят нарушения, которые приводят к неконтролируемому делению и росту клеток, который может быть как доброкачественного, так и злокачественного характера. Иммунная система играет важную роль в противоопухолевой защите: фагоциты немедленно отыскивают перерожденные клетки и уничтожают их, предотвращая таким образом онкологические заболевания.

3. Участие в процессе апоптоза

В среднем организм взрослого человека – это примерно 100 триллионов клеток, среди которых некоторые живут несколько суток, другие являются «долгожителями» и живут по несколько лет. Ежедневно гибнет около 70 миллиардов клеток, которые удаляют макрофаги. При естественной гибели клеток, они выделяют некие вещества, на которые реагируют фагоциты и уничтожают старые клетки. Этот процесс называется апоптозом.

4. Защита от болезней

Фагоцитарные образования способны предотвращать заболевания, которые не связаны с инфекцией, опухолью или другими факторами, интересными для фагоцитов. Например, при атеросклерозе макрофаги участвуют в замедлении прогрессии заболевания. Когда холестерин откладывается в эндотелии сосудов, макрофаги «поедают» частицы жира и вместо него образуются так называемые пенистые клетки. Но фагоцитарные клетки не способны полностью уничтожать липопротеины, поэтому холестериновые бляшки продолжают образовываться на стенках сосудов, хотя в некоторых случаях и несколько медленнее.

5. Поддержка функций иммунной системы

Фагоцитарные клетки обладают способностью повышать активность друг друга, а также других агентов иммунной системы. Кроме того, фагоциты выделяют специфические вещества, которые стимулируют костный мозг на выработку клеток иммунной системы.

6. Способствуют восстановлению тканей

Фагоциты также могут участвовать в формировании тканей при их повреждении за счет образования рубцовых клеток (фибробластов). В результате в месте повреждения появляется «латка» в виде рубца. Этот процесс происходит не только при внешних повреждениях кожи. Фибробласты незаменимы для рубцевания язвы органов ЖКТ и заживления миокарда в постинфарктный период.

Как «работают» фагоциты в человеческом организме

Фагоциты имеют важное защитное значение для организма. Они препятствуют размножению вирусов и токсичных веществ

Клетки-поглотители обладают характеристиками, благодаря которым могут вырабатывать биоактивные вещества, запускать реакции воспаления, стимулировать работу других иммунных агентов. 

Процесс захвата вредоносного тела предполагает перемещение фагоцита к нему, обволакивание «чужака» и его поглощение. После этого фагоцитарная клетка уничтожает патоген при помощи образовавшегося оксида азота и окислителей. Остатки расщепления выводятся из организма через лимфу.

Причина № 4: кусь безбилетный

Это даже скорее не причина, а следствие трогоцитоза для его косвенных бенефициаров. Находчивый внутриклеточный паразит, Francisella tularensis, умеющий выживать внутри макрофагов и разгуливать по их цитоплазме, научился использовать трогоцитоз с пользой для себя. Ведь когда один макрофаг кусает другой, для F. tularensis появляется прекрасная возможность инфицировать новые клетки, не вылезая из укрытия и не попадая в поле зрения иммунной системы во внеклеточном пространстве. Чтобы это продемонстрировать, микробиолог Том Кавула проделал следующий эксперимент. Культуру макрофагов заражали F. tularensis в количестве около 500 бактерий. На следующий день выяснилось, что уже более 500 макрофагов успели инфицироваться, хотя этого времени было совершенно недостаточно, чтобы бактерии успели пройти свой обычный цикл размножения и проникнуть в новые хозяйские клетки . В последнее время такой феномен получил свое собственное название: мероцитофагия. Некоторые исследователи считают, что бактерия просто пассивно пользуется такой возможностью, в то время как другие предполагают, что, возможно, существуют какие-то бактериальные механизмы стимуляции подобного поведения со стороны макрофагов.

Видео 1. F. tularensis (окрашены зеленым цветом) «путешествуют» от инфицированных макрофагов к другим, таким образом их заражая.

Видео 2. Покадровая съемка: F. tularensis (окрашены зеленым цветом) «путешествуют» от инфицированных макрофагов к другим, таким образом их заражая.

Этапы фагоцитоза

1. Хемотаксис. Инородная частица, проникнувшая в организм, выделяет хемоаттрактанты. Эти частицы дают сигнал иммунной системе о наличии вредоносного объекта. Запускается процесс биохимических реакций.  Сначала в кровь выбрасываются соединения, которые вызывают воспалительный процесс. Старт воспаления активизирует фагоциты. Нейтрофильные гранулоциты (подвид лейкоцитов), «почувствовав» присутствие хемоаттрактантов, совершают выход из крови в ткани, чтобы отправиться к очагу воспаления. Проникновение агрессора в организм запускает процесс, подобный эффекту домино: включается множество физиологических явлений клеточного и субклеточного рода. Их количество исчисляется сотнями. 
2. Адгезия. После того, как клетки поглощения приблизились к патогену, они протягивают к вредителю свои отростки, связываются с ним и идентифицируют его. Процесс захвата не происходит мгновенно, поскольку фагоциты должны убедиться, верно ли они распознали вредоносного агрессора с помощью своих рецепторов. 
3. Активация мембраны. Третья по последовательности стадия характеризуется подготовкой мембран на поверхности клеток-защитников к обволакиванию и ликвидации патогена.
4. Погружение. Мембрана, представляющая собой пластичную субстанцию, при контакте с чужеродным объектом меняет форму. Сначала фагоцит протягивает к вредителю отростки, затем растекается вокруг, наползает на инородную частицу и поглощает ее.
5. Образование фагосомы. Фагосома представляет собой пузырек внутри клетки-защитника. Он образуется в результате полного захвата «чужака» и наружного замыкания мембраны. Патоген остается блокированным внутри фагосомы.
6. Формирование фаголизосомы. Параллельно с предыдущими стадиями фагоцитоза, внутри клетки-поглотителя активизировались органеллы (лизосомы с «пищеварительными» ферментами клетки). Сразу после захвата вируса эти органеллы подходят к плененной частице. Происходит слияние мембран лизосом с оболочкой фагосомы. Содержимая в органелле жидкость изливается в пузырь. Таким образом, лизосомы представляют собой оружие против вредоносного объекта.
7. Киллинг. Под воздействием органеллы захваченная частица переваривается. Затем пузырь, в котором был заблокирован агрессор, расщепляет его.
8. Удаление продуктов расщепления. На этом этапе происходит чистка организма от остатков уничтоженного патогена. Мешочек с расщепленным вредителем приближается к внешней мембране фагоцита и соединяется с ней. Так происходит удаление остатков поглощенной инородной частицы из клетки. Фагоцитоз на этом завершается.

Всегда ли фагоциты полезны

Действие фагоцитов вследствие некоторых факторов может быть пагубным для человека. К таким условиям относятся плохая экология, постоянные стрессовые ситуации и др.

В механизмах работы клеток-защитников происходят сбои. Примером нарушения деятельности фагоцитов служит группа аутоиммунных заболеваний, развитие которых имеет следующее объяснение. Данный вид недугов возникает, когда иммунные клетки начинают воспринимать собственные клетки организма в качестве вредоносных объектов. Происходит фагоцитоз тканей почек, суставов, частей сердца. Как следствие, ускоряется процесс старения организма.

Чтобы избежать подобного рода болезней, стоит придерживаться здорового питания, вести активный образ жизни, не иметь вредных привычек и поддерживать нормальную работу иммунной системы.

Заключение

Учитывая, что лечение неспецифичное и, зачастую, симптоматическое, в ход идут и реакции, обусловленные приемом лекарств: жаропонижающие и противовоспалительные препараты создают повышенную нагрузку на ферментные системы печени и почек, а антибиотики отрицательно действуют на микрофлору человеческого организма и способствуют развитию антибиотикорезистентности патогенных микроорганизмов. В общем, кроме истребления патогенных микроорганизмов в промежуток времени, соответствующий острой фазе болезни, ничего хорошего от антибиотиков ждать не приходится.

К тому же, если пациент пропивает неполный курс антибиотиков или неверно подбирает дозировку, листериоз может перейти в хроническую форму, что будет сопровождаться дисбалансом в иммунной системе, а сам пациент станет дополнительным резервуаром инфекции.

Все эти последствия инфицирования вкупе с легкостью заражения диктуют необходимость разработки новых, более действенных и, в идеале, более безопасных методов лечения и профилактики. Так, уже достигнуты некоторые успехи в разработке препаратов, ингибирующих бактериальные киназы — одни из важнейших ферментов листерий , а вакцина на основе ослабленных Listeria оказалась не только действенным методом в предотвращении листериоза, но и показала способность усиливать эффективность противоопухолевой терапии .

Понимание механизмов распространения внутриклеточных патогенов является, возможно, толчком к разработке новых лекарственных препаратов, чьей мишенью станут белки, взаимодействующие с цитоскелетом или молекулами адгезии, или, к примеру, лизины. Такие препараты дадут возможность действовать на разные звенья патогенеза, ограничивая проникновение, распространение и размножение паразитов. Кто знает, возможно, в будущем механизм парацитофагии или подобный ему поможет понять и описать нормальные физиологические или патологические процессы?